实验概要 本实验介绍了从酵母中分离制备蛋白质和 RNA 的原理和方法。实验原理酵母细胞富含蛋白质和核酸。用稀碱液（0.2% 的氢氧化钠）处理酵母使细胞裂解，离心收集上清液，得到酵母核蛋白抽提液。用盐酸调节抽提液 pH 至 3.0 （核蛋白的等电点），核蛋白溶解度下降大量沉出，离心收集沉淀物为酵母蛋白质粗制品。酵母核蛋白是一种结合蛋白质，是蛋白质与核酸的复合物。酵母核酸主要是 RNA （含量为干菌体的 2.67 ％-10.0 ％）， DNA 含量较少，仅为 0.03％ -0.516％。如设法使酵母核蛋自中的蛋白质与核酸分离并除去蛋白质和 DNA ，就可得到较纯的 RNA 制品。这可通过以下操作完成：将核蛋自制品溶于含有 SDS 的缓冲液中，加等体积的水饱和酚，剧烈振荡后离心，溶液分成两层，上层为水相含有 RNA，下层为酚相，变性蛋白及 DNA 存在于酚相及两相界面处。吸出水相并加乙醇即可沉淀出酵母 RNA。若用氯仿-异戊醇进一步处理 RNA 制品，可获得纯度更高的 RNA。工具/原料more主要试剂 1. 0.2％ NaOH 溶液2. 6 mol/LHCl 溶液3. 95％乙醇4. SDS-缓冲液：0.3% SDS，0.1 mol/L NaCl，0.05 mol/l 乙酸钠，用乙酸调到 pH5.0 5. 饱和酚液：重蒸苯酚用4溶液饱和6. 氯仿一异戊醇液：24 ：1(V/V) 7. 含2%乙酸钾的95％乙醇溶液8. 无水乙醇9. 乙醚主要设备1. 离心机2. 干燥箱3. 恒温水浴4. 真空千燥器5. 天平6. 751 型分光光度计7. 冰箱8. 量筒（50ml）9. 蒸发皿10. Eppendorf 管（1.5 ml）11. 烧杯（50m1，100ml）实验材料鲜酵母或干酵母粉，pH0.5一5.0的精密试纸。步骤/方法1/1分步阅读

1. 酵母核蛋白的提取

称取鲜酵母 30g 或干酵母粉 5g, 倒入 100ml 的烧杯中。加入 40ml 0.2%NaOH 溶液，在 20-40℃水浴上搅拌提取 30-60min 后 4000r/min 下离心 10min, 取上清液于 50ml 的烧杯中，并置于放有冰块的 250ml 烧杯中冷却，待冷至 10℃以下时，用 6mol/L HCl 小心地调节溶液的 pH 至 3.0 左右。随着 pH 下降，溶液中白色沉淀逐渐增加，到等电点时沉淀最多（注意严格控制 pH ）。 pH 调好后继续于冰水中静置 l0min ，使沉淀充分，颗粒变大。将此悬浮液以 3000r/min 离心 20min ，倒掉上层清液。将沉淀物转入蒸发皿内，放入真空干燥器或干燥箱中干燥之后称重，这就是酵母核蛋白粗品。

2. 苯酚法提取酵母 RNA

取上述核蛋白研碎，加 10ml SDS-缓冲液使成匀浆，洗入各 Rppendorf 管（略少于管容积的一半），室温静置 10min ，再加等体积的饱和酚液，室温下剧烈振荡 5min 后置冰浴中分层， 4000r/min 离心 10min ，吸出上层清液，转入新的 Eppendorf 管，加 2 倍体积 95％乙醇（含2％乙酸钾），在冰浴中放置 30min ，使 RNA 沉淀。再以 10 000r/min 离心 5min ，弃上清液，沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次，迅速离心各 lmin ，保留沉淀。倾去乙醚后，减压真空干燥，准确称重，记录。3. 结果处理

1) 计算核蛋白提取率

2) RNA 含量测定

将干燥后的 RNA 产品配制成浓度为 10~50 μg/ml 的溶液，在 751 型分光光度计上测定 260nm 处的吸光度，按下式计算 RNA 含量：

式中， A260 为 260nm 处的吸光度； L为比色杯光径（cm）； 0.024 为 1ml 溶液含 1ugRNA 的吸光度。

3) 计算 RNA 提取率

注意事项

注意事项

1 .利用等电点控制核蛋白析出时，应严格控制 pH 。

2 .用苯酚法制备 RNA 过程中，用乙醇沉淀得到的 RNA 中，除 RNA 外还含有部分多糖，本实验用用 2% 乙酸钾去溶解非解离的多糖以达到纯化 RNA 的目的。

酵母