首先，根据Mabuchi等报道的鱼类通用引物扩增mtDNA部分序列，剩余基因序列通过引物步移得到。反应模板DNA约为100ng,25μL反应体系包括:ExTaq酶0.25μL(2U),10xExTaqBuffer2.5μL，dNTPs1μL(各2.5mmol/L),引物各0.5μL(20umol/L)。

然后，PCR反应程序:94C预变性3min;94°C变性30s,60C退火30s(退火温度依特定引物)，72°C延伸1min,35个循环;最后72C延伸10min,4C保存。

然后，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物由上海生工生物技术服务有限公司纯化，用ABI3770XL自动测序仪进行Sanger法双向测序。

然后，全序列的拼接与注释，通过NCBIBLAST检索，确定所得序列与GenBank中所收录的沙塘鳢属鱼类mtDNA相应区段有较高序列相似性后，利用测序峰图结果分析软件DNABaserV和ContigExpress。

然后，将所有片段拼接成一个完整的mtDNA,辅以人工校正。用Editseq7.10和Mega5.0统计序列总长、碱基组成和AT含量等信息;用在线软件tRNAscan-SE1.2112进行tRNA基因定位并对二级结构进行预测，并辅助人工校正，对于tRNAscan-SE1.21未能预测的tRNA。

最后，采用RNAstructure4.615预测茎环结构.mtDNA全序列经MitoFish4注释后，提交GenBank(KF874495)，用DNAMANS)和Geneiousv.5.4构建mtDNA结构简图。

上述方法为小编整理所得，希望能够帮助到大家。