流式细胞术实验步骤？

一、流式细胞术检测细胞胞膜分子

1.细胞重悬：细胞处理计数后，用细胞洗液（含2% BSA的PBS）重悬细胞，使细胞浓度为1×107/mL；

2.对照设置：空白对照、同型对照、待测样本每管取100uL上述重悬的细胞，使每管细胞数达到1×106/管；

3.一抗孵育：空白对照管不加抗体，同型对照管和待测样本管分别加入5-20uL同型抗体和靶标抗体（具体使用量参照说明书），充分混匀，至4℃孵育30min或冬季可至于室温孵育30min，孵育期间每隔10min晃动一下反应管，使细胞和抗体充分反应；

4.细胞清洗：加入适量细胞洗液，1000rpm离心5min，弃上清，反复洗涤2次；

5.细胞重悬：使用100μL细胞洗液重悬细胞；

6.二抗孵育：同型对照管和待测管分别加入适量的荧光标记的二抗，充分混匀，至4℃避光孵育30min或冬季可至于室温避光孵育30min，孵育期间每隔10min晃动一下反应管；

7.细胞清洗：加入适量细胞洗液，1000rpm离心5min，弃上清，反复洗涤2次；

8.上机检测：使用100-200μL细胞洗液重悬细胞，先测空白管和同型对照管，再测待测管。

二、流式细胞术检测细胞胞浆分子

1.准备细胞：细胞处理计数后，1000rpm离心5min，弃上清，用细胞洗液（含2% BSA的PBS）涤细胞一次；

2.细胞固定：按照每2×106个细胞加入1mL 4%多聚甲醛的比例使用4%多聚甲醛固定细胞，室温固定10~15min；

3.细胞清洗：加入细胞洗液，1000rpm离心5min，弃上清，重复清洗一次；

4.细胞破膜：用破膜剂重悬细胞，加入至1.5mL EP管中，1*106/管，体积为100μL/管；

5.对照设置：空白对照、同型对照、待测样本每管取100uL上述重悬的细胞，使每管细胞数达到1×106/管；

6.一抗孵育：空白对照管不加抗体，同型对照和待测管分别加入5-20uL同型抗体和靶标抗体（具体使用量参照说明书），充分混匀，至4℃孵育30min或冬季可至于室温孵育30min，孵育期间每隔10min晃动一下反应管，使细胞和抗体充分反应；

7.细胞清洗：加入适量的穿膜剂，1000rpm离心5min，弃上清，重复洗涤细胞2次；

8.细胞重悬：用100uL穿膜剂重悬细胞；

9.二抗孵育：同型对照管和待测管分别加入适量的荧光标记二抗，充分混匀，至4℃避光孵育30min或冬季可至于室温避光孵育30min，孵育期间每隔10min晃动一下反应管；

10.细胞清洗：加入适量的穿膜剂，1000rpm离心5min，弃上清，重复洗涤细胞2次；

11.上机检测：用100-200uL穿膜剂重悬细胞，先测空白管和同型对照管，再测待测管。